近日，中国农业科学院植物保护研究所周雪平团队与北京市农林科学院李少芳团队联合在国际知名学术期刊Science Bulletin (IF=21.1）在线发表题为“Epi-transcriptome analysis reveals the lack of N6-methyladenosine modification in two RNA viruses infecting watermelon”的研究论文。该研究综合运用三种原理不同的m⁶A检测方法，揭示了侵染西瓜的两种细胞质复制型RNA病毒——瓜蒌斑驳花叶病毒（trichosanthes mottle mosaic virus, TrMMV）和西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus, ZYMV）的RNA中缺乏N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰，为植物病毒表观转录组学研究提供了新见解。
N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物mRNA中最常见的内部修饰，发生于腺苷酸第六位氮原子上，在基因表达调控中发挥重要作用。该修饰主要由定位于细胞核的甲基转移酶复合物（m6A methyltransferase complex, MTC）催化完成。尽管m⁶A表观转录组测序技术显著推动了该领域的研究，但容易产生的假信号可能导致一些错误结果。比如，早期基于抗体免疫沉淀测序技术m⁶A-seq的研究曾报道，包括基孔肯雅病毒（chikungunya virus, CHIKV）和登革热病毒（dengue virus, DENV）在内的多种细胞质复制型病毒存在m⁶A修饰；然而，近期采用不依赖抗体的m⁶A测序技术（如SELECT、Direct RNA Sequencing）的研究表明，这些病毒实际缺乏m⁶A修饰。这种争议现象凸显了在病毒表观转录组研究中技术选择的重要性，也提出了关键科学问题：细胞质复制型病毒RNA是否普遍存在m⁶A修饰？
该研究聚焦侵染西瓜的两种细胞质复制型病毒TrMMV与ZYMV，首先以感染病毒的西瓜叶片总RNA为模板，并体外转录出无修饰的RNA作为阴性对照。利用m⁶A RIP-seq技术平行检测总RNA样品和阴性对照RNA样品。结果显示，尽管在总RNA样品中的病毒RNA上检测到m⁶A富集峰，但在阴性对照的病毒RNA上也发现了同等程度的富集峰。这表明TrMMV与ZYMV病毒RNA不含m⁶A修饰，且m⁶A RIP-seq的假阳性信号可通过阴性对照有效排除。
为进一步验证这两种病毒的m⁶A修饰情况，该研究应用不依赖于抗体的GLORI-seq技术对其进行检测，结果同样证实两种病毒RNA缺乏m⁶A修饰。鉴于ZYMV病毒RNA具有poly(A)尾，因此进一步采用纳米孔直接RNA测序技术（Nanopore Direct RNA Sequencing, DRS）对其进行分析。通过设置严格的p-value阈值或加入阴性对照，DRS结果同样显示，ZYMV病毒RNA中未检出可信的m⁶A修饰信号，同时也不存在m⁵C、A-to-I编辑及Ψ修饰。
该研究揭示，细胞质复制型植物RNA病毒中，m⁶A修饰可能并非普遍存在。该结果不仅凸显了在病毒及寄主内源RNA表观修饰研究中设置严格阴性对照的关键作用，也为未来相关研究提供了降低假阳性、实现无偏倚检测的重要方法学策略。
博士生潘福安、博士后荆嘉贤为论文的共同第一作者，周雪平教授和李少芳研究员为共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、北京市蔬菜研究中心创新发展项目及高层次人才启动基金支持。
论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S209592732500739X?via%3Dihub
