近日，中国农业科学院植物保护研究所抗病虫作物生态安全评价与利用创新团队在国际期刊《Journal of Advanced Research》上发表题为“Efficient large-fragment isogenic sequence replacement in rice via prime editing with engineered reverse transcriptase variants”的研究论文。该研究针对植物基因组中大片段同源序列替换（Isogenic Sequence Replacement, ISR）效率极低、操作尺度严重受限的技术瓶颈，系统比较了多种衍生先导编辑（Prime editing, PE）策略，揭示了pegRNA序列中微同源性引发副产物的关键机制，并通过改造的逆转录酶，成功建立了一套高效的长片段同源序列替换技术，为植物功能基因组学研究和抗病育种提供了重要工具。

大片段同源序列替换，是在不改变遗传背景的前提下直接引入优良等位变异的理想路径。然而，植物细胞中间源定向修复效率极低，常规PE的操作窗口大多局限在40 bp以内，远不能满足大片段替换的需求。已有衍生PE策略虽能实现大片段插入，但在同源序列替换场景中，由于修复模板与内源位点高度同源，极易引发竞争性退火和非预期副产物，导致替换效率极为低下。如何突破这一瓶颈，一直是植物基因组编辑领域的核心难题。

为此，研究人员首先在水稻原生质体中系统评估了NM-PE、TJ-PE和GRAND PE三种衍生策略的ISR性能。结果表明，TJ-PE策略在OsMPK13、OsCDC48和OsEPSPS三个位点均展现出最高的精准ISR效率，最高可达GRAND PE策略的8倍，且副产物显著减少。稳定转化实验进一步证实，TJ-PE策略在T0代植株中的精准ISR编辑效率可达50%，远优于其他策略。进一步分析发现，pegRNA中PBS与RTT之间的微同源性会引发RTT与非靶标链的错误退火，导致大量副产物产生。通过引入单核苷酸错配破坏该微同源性，可显著抑制副产物并提升精准编辑效率。在此基础上，研究人员对M-MLV逆转录酶进行了系统改造，筛选出高效变体rPE14e4（T128N/D200C/V223Y/L435K）。与初始版本rPE14a相比，rPE14e4将精准ISR效率平均提升4.5倍，并将操作尺度扩展至250 bp（148 bp、193 bp、250 bp的替换效率分别为6.25%、8.93%和4.54%），同时未检测到明显的脱靶效应。最后，利用rPE14e4介导的TJ-PE系统，研究团队在粳稻品种南粳9208中成功完成了xa10基因174 bp编码区的精准重写（编辑效率5.00%），首次在植物中实现了超过150 bp的内源等位基因原位精准矫正。

本研究开发的精准高效ISR系统，不仅丰富了植物基因组编辑工具库，也为其他植物（尤其是双子叶植物）中的同源序列替换提供了新策略。通过在优良品种中实现高达250 bp的精准替换，精准矫正病害或胁迫相关的等位基因，缩短育种周期，为中间育种材料的精准利用和现有商业品种的迭代升级开辟了新路径。

中国农业科学院植物保护研究所博士研究生张素杰为论文第一作者，周焕斌研究员为通讯作者，团队多名成员共同参与完成；北京农林科学院李少芳研究员和中国农科院植保所周雪平教授也参与了相关研究工作。该研究得到了国家重点研发计划、农业生物育种重大专项、中国农业科学院南繁专项项目及中国农业科学院科技创新工程等项目的支持。

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123226004595