近日，中国农业科学院植物保护研究所周焕斌研究员团队在国际知名学术期刊Molecular Plant《分子植物》（IF="“9.326”）上发表了题为 “Cas9-NG greatly expands the targeting scope of genome-editing toolkit by recognizing NG and other atypical PAMs in rice”“Cas9-NG核酸酶通过识别NG和其它非典型性PAM序列极大扩展各水稻基因编辑技术的应用范围”的研究论文，该研究从PAM识别序列角度，利用Cas9-NG对水稻CRISPR基因组定点编辑技术各种相关工具进行了全面升级。

基于CRISPR/Cas9的水稻基因组编辑技术的出现和应用，使得水稻功能基因组学研究和分子育种变得更加高效便捷。现今常用的各种基因组编辑工具大多基于SpCas9蛋白架构，需要识别编辑靶位点的NGG PAM序列而行使功能。这对于特定位点核苷酸进行单碱基编辑时，往往造成无打靶sgRNA可利用，由此存在一定局限性。

为了扩展水稻基因组定点编辑技术，尤其是各种单碱基编辑器在水稻上的使用范围，该团队首先探索了识别NG PAM的Cas9-NG和xCas9两个蛋白核酸酶对水稻基因组的切割属性。发现Cas9-NG优于xCas9蛋白，除了传统NGG位点外，对NGA和NGT位点表现出喜人的识别特性，对NGC位点也具有一定的切割能力。进一步研究表明，Cas9-NG在水稻中对NAC, NTG, NTT和NCG等PAM也能识别。由此，该团队开发了一系列基于Cas9-NG架构的各种水稻基因组定点编辑工具，并成功用于水稻单基因敲除、多基因敲除、单碱基编辑以及靶基因转录激活调控。如：水稻胞嘧啶碱基编辑器rBE22（hAID*∆-Cas9n-NG-UGI）实现 OsBZR1 靶碱基C向T的定向替换，获得了预期 OsBZR1(P206L) 材料。腺嘌呤碱基编辑器rBE23（TadA:TadA7.10-Cas9n-NG）将 OsSERK2 的一个病原响应磷酸化位点的靶碱基A替换为G，效率达40.43%等。

Cas9-NG在水稻上的成功应用，在一定程度上突破PAM识别序列的限制，实现了水稻基因组可编辑位点八倍提高，众多之前无法进行碱基编辑的位点如今可进行操作，大大扩展了靶向范围，这对于水稻基因功能解析和分子精准育种具有重要促进作用，加速实现水稻缺陷型基因的修饰矫正，有利于缩短水稻育种进程和延长现有优良品种的应用周期。

该研究由中国农业科学院植物保护研究所周焕斌课题组、周雪平课题组和四川大学生命科学学院林宏辉课题组合作完成。植物保护研究所客座博士研究生任斌和硕士研究生柳浪为共同第一作者，周焕斌研究员和林宏辉教授为本文的共同通讯作者。本研究得到相关工作得到了基金委自然科学基金（31871948），国家重点研发计划项目（2017YFD0200900）和中国农科院创新工程的资助。

文章链接： https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.03.010